Inseminação artificial em cães com sêmen congelado

As primeiras citações sobre inseminação artificial (IA) usando sêmen congelado/descongelado em cães foram datadas de 1969 (Seager, 1969). Em 1982, foi registrada pelo American Kennel Club (AKC) a primeira ninhada nascida após a IA com sêmen congelado. Já no Brasil a CBKC registrou a primeira ninhada em 2001 (Souza & Martins, 2015).


O que é Inseminação Artificial (IA)? é o processo pelo qual se realiza a deposição do sêmen no genital da fêmea (vagina ou útero) de forma não convencional (monta natural). Tem como objetivo a obtenção de prenhêz positiva e especificamente em caninos, prenhêz com tamanho de ninhada condizente com a raça em questão. Prenhêz positiva é resultado do sucesso do evento da fertilização dos óvulos (gametas femininos) pelos espermatozoides (gametas masculinos). Isso implica que 50% da responsabilidade sobre o sucesso da prenhêz recai sobre a fêmea e os outros 50% recaem sobre o sêmen – aqui no caso o sêmen criopreservado/descongelado – e na técnica de IA utilizada. Um capitulo a parte poderia ser descrito sobre as responsabilidades da fêmea, mas podemos citar, minimamente, que os aspectos sanitários, nutricionais, saúde do aparelho reprodutor feminino e a definição do melhor momento da inseminação devem ser considerados.


Quais as indicações de IA? É indicada em (i) qualquer tipo de acasalamento que não ocorra normalmente (devido alterações comportamentais ou físicas seja do macho ou da fêmea); (ii) por direcionamento de acasalamento de indivíduos geograficamente distantes, com uso de sêmen resfriado ou congelado; (iii) por segurança sanitária (por evitar contato físico entre indivíduos de aspecto sanitário desconhecido); (iv) por aproveitamento de material genético preservado mesmo após a morte do macho, no caso de uso de sêmen congelado. Pode-se portanto, fazer um paralelo entre indicações e vantagens da IA como ferramenta de reprodução animal.


Como definir o melhor momento da IA? Os métodos mais confiáveis são através de dosagem de progesterona (P4) por radioimunoensaio em amostras de soro sanguíneo, quando encontra-se níveis entre 8-12ng/dL de P4 circulante e/ou através de esfregaço vaginal caracterizado por mais de 90% de células epiteliais anucleadas queratinizadas. Em ambos os casos procure um médico veterinário especializado para realização desses procedimentos. A definição do período ideal para realização da IA é importante pois esses indicativos demonstram qual o momento das ovulações na cadela e aumentam as chances de fertilização dos óvulos pelos espermatozoides já presentes no útero. Os espermatozoides podem se manter viáveis por 7-10 dias na luz do útero; os óvulos são viáveis por 48-72hs após a ovulação; todavia, o sucesso da IA depende do encontro, no momento certo, entre óvulos e espermatozoides. Daí a necessidade de estabelecimento de regras e definição do melhor momento para IA.


Qual técnica de IA usar? Várias são as técnicas de IA indicada para fêmeas caninas, Pode-se citar como metodologias a IA vaginal (fundo de saco vaginal) ou uterina (transcervical e intrauterina, por vaginoscopia, sonda de Osíris, laparoscopia, ou laparotomia). A metodologia vaginal (pipeta plástica) é a menos invasiva e, portanto, a de uso preferencial por praticamente não ter contraindicações de uso. As metodologias intrauterinas dependem de procedimentos técnicos (sonda de Osiris, vaginoscopiopara guiar a deposição do sêmen na cérvix) ou de procedimentos cirúrgicos (laparoscopia ou laparotomia abdmominal para deposição do sêmen do corno uterino), ou seja, procedimentos mais invasivos. Existe uma relação indiretamente proporcional quanto quantidade de espermatozoides viáveis e o local de deposição do sêmen, ou seja, conceitualmente, sêmen de menor qualidade exige procedimentos mais invasivos. Tal fato imputa pontos negativos e desvantajosos à técnica de IA em cadelas. Assim sendo, a manutenção da viabilidade espermática, independente dos procedimentos a que ele seja submetido (diluição, resfriamento, congelação e descongelação) é condição imprescindível para que se possa inseminar cadelas com técnicas menos invasivas e realmente vantajosas. Portanto, novamente, elucida-se como fatores importantes a qualidade de diluidores de sêmen utilizados e a validação de procedimento de resfriamento, congelação e descongelação do sêmen com intuito de manter uma quantidade de células espermáticas com qualidade e viabilidade minimamente desejáveis para uma IA vaginal e atraumática.


Qual a doseinseminante recomendada? A quantidade de espermatozoides a ser depositada é controversa entre os autores. Há citações recomendando de 25 a 800 milhões de espermatozoides morfologicamente normais e móveis, porem considera-se que um mínimo 150 milhões de espermatozoides morfologicamente normais e móveis seja a dose inseminante recomendada. A literatura cientifica aceita uma quantidade de espermatozoides menorquando se realiza uma IA intrauterina, quando comparada com IA vaginal. Aqui cabe um aparte: espermatozoides móveis não significam espermatozoides completamente viáveis. A célula espermática, apesar de pequena, carrega uma fisiologia complexa para se mover até o gameta masculino e fertilizá-lo, ademais, no caso de sêmen congelado, deve ainda suportar os procedimentos de congelação e descongelação. Portanto, o conceito de viabilidade espermática deve ser considerado na determinação da dose inseminante.

Apenas como informação o ejaculado de um cão pode conter de 200 milhões a 2 bilhões de espermatozoides – variações dependentes de raça, idade, condicionamento e frequência de coleta (Martins, Souza & Ackerman, 2015). Isso implica em célula suficiente para 1 a 20 doses inseminantes por ejaculado.


Qual a taxa de sucesso esperada com uso da IA em cães? É sabido que a fertilidade natural de cães é considerada bastante alta (acima de 80%) quando comparada com outras espécies. O uso de sêmen à fresco e/ou resfriado praticamente não interfere nesses índices, mantendo a taxa de sucesso bastante satisfatória. Todavia, sempre que há maior manipulação ou interferência humana, deve-se ter preocupações com mitigação de possíveis erros durante o processo, para que se obtenha a prenhêz desejada. Ou seja, IA com sêmen congelado é o procedimento que requer maior controle dos especialistas para mitigação de possíveis falhas.

A literatura cita diversos trabalhos que descrevem taxas de sucesso variável – de 30 a 80% de sucesso, sendo aceitável como média, 50%. A mitigação de erros envolve:

• Status sanitário da matriz adequado – calendário de vacinações, vermifugações e ausência de doenças infecciosas, crônicas, metabólicas entre outras;
• Status nutricional da matriz condizente com caráter reprodutivo – ideal fêmeas estarem nem gordas nem magras demais, pois ambas as situações interferem em taxa de ovulação;
• Determinação do momento ideal para inseminação – dependendo do perfil hormonal e da citologia vagina, seu médico veterinário deverá indicar 01 ou 02 inseminações na matriz;
• Qualidade da dose inseminante: deve-se considerar como uma boa dose inseminante aquela que contem pelo menos 150 milhões de espermatozóides móveis e isentos de defeitos morfológicos após a congelação/descongelação.
• Metodologia de IA baseada em procedimentos higiênicos e seguros à matriz e sempre realizados por técnicos treinados e capacitados.

O uso de Sêmen congelado dá resultado na IA? Conforme já elucidado, existem várias formas de se aproveitar um ejaculado – à fresco in natura, à fresco diluído, resfriado diluído (4-15ºC) ou congelado (-196ºC). As formas à fresco devem ser utilizadas em curto espaço de tempo e com certa restrição geográfica (macho e fêmea devem estar próximos). O sêmen resfriado já amplia o período de uso para 72-96hs após a coleta e diluição e possibilita o transporte do sêmen, minimizando distâncias entre os padreadores. O sêmen congelado tem as grandes vantagens de (i) ter prazo de validade ilimitado (se, e somente se mantidas as condições de armazenamento em botijão de nitrogênio líquido adequadas); (ii) de possibilitar o transporte desse sêmen até mesmo entre diferentes países (desde que se respeitando aspectos sanitários); (iii) de reduzir distancias entre padreadores. Assim, torna-se a forma mais vantajosa sob o ponto de vista de preservação de material genético diferenciado.

Cabe salientar que existem aspectos inerentes ao indivíduo (reprodutor) sob o quesito aproveitamento do ejaculado congelado - alguns ejaculados podem resistir melhor às intempéries da congelação/descongelação que outros, criando um perfil de aproveitamento do indivíduo (reprodutor) que pode ser classificado com de alta, média ou baixa congelabilidade do sêmen. O condicionamento e frequência de coletas geralmente melhoram a qualidade do ejaculado com o passar do tempo.

Em outras palavras, não é todo ejaculado encaminhado para congelação que poderá ser aproveitado após procedimentos de congelação/descongelação. Por isso, mesmo, em se respeitando procedimentos de diluição, resfriamento, congelação e descongelação, os ejaculados devem ser avaliados após os procedimentos de congelação/descongelação para estarem aptos ou não à utilização em procedimentos de IA. Há padrões mínimos de qualidade espermática que devem ser respeitados para se aprovar uma partida de sêmen à utilização. Esses padrões são conhecidos pelos médicos veterinários especialistas em reprodução animal.

Em se utilizando sêmen com padrão adequado e mitigando os erros tem-se uma taxa de obtenção de sucesso boa (60%), conforme demonstra a literatura (vide tabela). Variação na taxa de concepção (parição) sempre pode existir, já que estamos tratando de biologia. Mas considerando que o procedimento de IA vaginal não incorre em malefícios às matrizes, sem prejuízo inclusive a vida reprodutiva destas, acredito que há mais benefícios a serem considerados em relação a malefícios.


Tabela – Taxa de concepção em cadelas submetidas a IA com sêmen congelado.

Autor	No. Cadelas	Método de IA	No. IA/Dose Inseminante	Taxa de Concepção	No. Filhotes/Ninhada
Cremonesi et al. 2005	14	Vaginoscopia	1 (-)	71.4%	5.5
Nizanki, 2005	18	Vaginal	1 (300 milhões)	27.8%	3
Nizanki, 2005	16	Vaginoscopia	1 (300 milhões)	68.7%	4.9
Nizanki, 2006	28	Sonda Osíris	1 (250 milhões)	60.7%	4
Nizanki, 2006	32	Sonda Osíris	1 (300 milhões)	59.4%	3.9
Pretzer, 2006	137	Vaginoscopia	1 (186 milhões)	89.4%	6.9
Thomassen et al. 2006	526-685 ciclos	Cateter Norueguês	1 (200 milhões)	73.1%	5.7

Fonte: Souza&Martins. Inseminação Artificial em cadelas. In Apparicio & Vicente, Reprodução e Obstetricia em cães e gatos. MedVet 2015.


Porque é comum ouvir o comentário de que sêmen congelado de cão não gera prenhêz? Desde das primeiras citações de sucesso com IA com sêmen congelado de cães em 1962, muitos métodos de criopreservação e descongelação têm sido desenvolvidos e testados. Quando se fala em metodologia de criopreservação, além de protocolos, deve-se também imputar o uso e caracterização química de diluidores de sêmen. Na literatura internacional, o diluidor de sêmen mais comumente citado em trabalhos com sêmen canino é o diluidor à base de TRIS, gema de ovo e glicerol (Szász et al. 2000). SANTOS et al (2000), por exemplo, já cita a possibilidade de uso de 05 diluidores de sêmen distintos para a congelação de sêmen canino, sendo eles à base de TRIS-Gema-Glicerol, a base de glicina, à base de lactose, à base de leite desnatado e à base de citrato-gema. O contrassenso é que todas essas formulações foram desenhadas considerando-se a fisiologia espermática da espécie bovino e não especificamente de sêmen e/ou espermatozoides de cães e/ou canídeos. O principal motivo disso, talvez seja o fato de que a criopreservação de sêmen é parte integrante de uma técnica maior (a inseminação artificial) que tem potencial de uso muito mais evidente em espécies de produção, quando comparadas como animais pet. A inseminação artificial em bovinos está muito mais elucidada e concretizada uma vez que são mais de 13 milhões de inseminações com sêmen congelado por ano, somente no Brasil (Asbia, 2015).

Com o passar dos anos, o mercado pet vem se profissionalizando e exigindo maior especificidade dos produtos da área. No âmbito da reprodução canina, inovações no desenvolvimento de novas fórmulas de diluidores de sêmen e de metodologias de criopreservação, descongelação e inseminação artificial vem acontecendo em função dessa pressão mercadológica. É nesse cenário que a Inprenha Biotecnologia vêm apresentando inovações ao mercado pet, conferindo profissionalismo e confiabilidade.


Quais os procedimentos para congelação do sêmen canino? Após a coleta do sêmen (geralmente realizada por masturbação com uso de mão enluvada), o ejaculado passa por uma avaliação macro/microscópica que verifica se o mesmo está dentro dos padrões mínimos recomendados. Caso não esteja recomenda-se o descarte.. Se estiver dentro dos padrões, o ejaculado é então submetido à diluição, ao resfriamento a temperatura de 4ºC, ao equilíbrio a 4ºC para estabilização osmótica entre meio diluidor e célula (período de 4-24hs), ao envase em palhetas, e posteriormente à curva de congelação, chegando aos -196ºC do nitrogênio líquido. Se mantido nessa temperatura de -196ºC o sêmen tem prazo de validade indeterminado (isso, se e, somente se, essa temperatura de -196ºC for sempre mantida, ou seja, a conferência dos níveis de nitrogênio e reposição são importantissimas). Todos esses procedimentos, sem exceção deverão ser realizados por especialista na área. São necessários equipamentos próprios para avaliação do sêmen e para os procedimentos de diluição, resfriamento e congelação.

Como já dito anteriormente, a dose inseminante recomendada é de 150 milhões de espermatozoides móveis e morfologicamente normais. Dose inseminante deve ser considerada a quantidade de células viáveis depositadas no genital da fêmea e não a quantidade de espermatozoides congelados por palheta.

Um detalhe importante – existem 02 tipos de palheta de sêmen congelado, com volumes diferentes, uma com 0.5mL outra com 0.25mL. A menor, confere melhor condições físicas as células durante os processos de congelação/descongelação, porem exige também, maiores cuidados com sua manipulação, evitando danos ao sêmen congelado. O tipo de palheta também pode interferir nos utensílios de IA.


Como se descongela o sêmen canino? A literatura demonstra várias metodologias de descongelação de sêmen canino : 37ºC por 30 segundos, 46ºC por 15 segundos ou 72ºC por 8 segundos. Tal variação existe em função do tipo de palheta e da curva de congelação utilizada. A dica é sempre utilizar a metodologia de descongelação recomendada pelo responsável da curva de congelação.

Com o sêmen congelado pela Inprenha Biotecnologia, recomendamos a descongelação em água a 35ºC por 20 segundos, sempre com a palheta na posição vertical, com a bucha voltada para baixo.

Dicas importantes:

• O controle da temperatura da água é de suma importância para manutenção da viabilidade espermática pós descongelação;
• Manipular a palheta sempre com pinça e nunca com os dedos;
• Manter as palhetas o mínimo de tempo possível no ar ao retirá-las do botijão de nitrogênio
• A manipulação de palhetas, raques e botijões deve ser realizada sempre por técnicos capacitados

DIFERENCIAIS INPRENHA PARA CONGELAÇÃO DE SÊMEN E IA EM CÃES:

A Inprenha Biotecnologia investe em soluções para que a qualidade seminal seja a melhor possível, possibilitando o emprego das doses em procedimentos de IA menos invasivos, se assim lhe convier. Trabalhamos com os seguintes diferenciais:

• Desenvolvimento de diluidores para congelação de sêmen de cães (DC-CRIO) – formulação especifica ao espermatozoide canino, considerando suas particularidades fisiológicas;
• Know-how de mais de 20 anos de experiência da equipe técnica em andrologia animal;
• Prévia verificação do perfil espermático do reprodutor, visando conhecer perfil espermático do mesmo, identificando se animal possui perfil espermático adequado para congelação;
• Criteriosa avaliação espermática, para determinação do aproveitamento do ejaculado para congelação ou não;
• Procedimento realizado em ambiente climatizado, evitando variações de temperatura e consequentemente, melhorando as condições de manipulação do sêmen;
• Uso de equipamentos computadorizados para controle de curva de congelação, o que possibilita maior padronização e homogeneidade entre todas as palhetas de sêmen da mesma partida;
• Criteriosa avaliação espermática no pós congelação/descongelação, incluindo avaliação por citometria de fluxo, determinando a quantidade de espermatozóides vivos/viáveis, complementando a avaliação seminal com parâmetros analíticos complementares aos parâmetros subjetivos de avaliação microscópica;
• Recomendação de IA vaginal com sêmen congelado, baseado na deposição de pelo menos 180 milhões de espermatozóides móveis, com morfologia normal, vivos e viáveis por procedimento.
• Armazenamento das doses de sêmen congelada em banco de sêmen específico, com regido controle de manutenção de nitrogênio.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Cremonesi F1, Salamon L, Groppetti D, Pecile A. Results of a single transcervical endoscopic insemination using frozen semen in the bitch. Vet Res Commun. Aug;29 Suppl 2:187-9. 2005.

Nizanki, W. Comparsions of results of intravaginal and intrauterine ineminsations of bitches with frozen-thawed sêmen . Vet-Med, v.8, n.4, p1-3, 2005.

Nizanki, W. Intravaginal insemination of bitches with fresh and frozen-thawed semn with adition of protatiic fluid: use of na infusion pipette and Ositris Catheter. Theriogenology, v. 66, p.4701-483, 2006.

Pretzer SD, Lillich RK, Althouse GC. Single, transcervical insemination using frozen-thawed semen in the Greyhound: a case series study. TheriogenologyApr 1;65(6):1029-36. Epub 2005 Aug 22, 2006.

Seager, S. W. Successsful pregnancies utilizing frozen dog semen. Artificial Insemination Diggest., v.17, p. 6-7, 1969.

SOUZA, F., F.; MARTIN, M.I. M. Inseminação Artificial em cadelas. In Apparicio & Vicente, Reprodução e Obstetrícia em cães e gatos. MedVet 2015

Thomassen R, Sanson G, Krogenaes A, Fougner JA, Berg KA, Farstad W. Artificial insemination with frozen semen in dogs: a retrospective study of 10 years using a non-surgical approach. Theriogenology. Oct;66(6-7):1645-50, 2006.